암 진단 기술 어디까지 왔나? - 1 μg (1/1000 mg) 유방암 시료에서 300개 이상 단백질 표지자를 한 번에 정량 분석할 수 있는 기술 개발 - 저렴한 비용으로 혈액 한 방울로 암을 진단할 수 있는 기반 마련 서울의대-서울대학병원 의공학과 김영수 교수, KIST 이철주 박사 공동연구팀 (이하 한국 Seoul 팀, 책임자 김영수 교수)은 질량분석기 (Triple Quadrupole Mass Spectrometer)의 다중반응검지법 (Multiple Reaction Monitoring, MRM) 을 이용하여 유방암 세포 시료 극미량 1 μg (1/1000 mg)으로 319개 단백질 표지자의 절대 정량 분석하는 기술을 개발하였다. 이 연구는 미국국립암연구원의 지원으로 미국 Fred Hutchinson Cancer Research Center 의 Amada Paoulovich 박사 (이하 미국 서부 Seattle 팀)과 BROAD Institute of Harvard and MIT 의 Steven Carr 박사 (이하 미국 동부 Boston 팀)과 공동으로 진행됐다. 우리 몸의 세포 형질을 결정하는 중요 요소는 유전자와 단백질이다. 현재 유전체 정보는 Next Generation Sequencing (NGS) 기술의 발전으로 비교적 쉽게 얻을 수 있지만, 단백질체 정량[특정 단백질 양(농도) 측정] 분석은 속도 및 규모에서 제한적으로 이뤄지고 있다. 암은 세포분열을 통한 증식과정에서 고유의 단백질을 만들어 내는데, 혈액을 뽑아서, 암세포가 분비한 단백질의 양을 측정하는 것이 종양표지자 검사다. 현재 종양표지자 검사는 암 세포가 분비한 단백질(항원)과 항체의 반응으로 농도를 측정한다. 종양표지자 마다 새로운 항체 분석법을 개발해야 하므로 시간과 비용이 많이 든다. 같은 검사를 해도 각 분석실험실마다 단백질 분석 편차가 있어서 표준화된 동일한 실험값를 얻기 어렵다. 이러한 고민에서 개발된 것이 질량분석기를 이용한 다중반응검지법이다. 이 검사법은 극미량 1 μg 시료의 한 번 검사로 100~300여개의 단백질 표지자를 한 번에 정량할 수 있다. 어떤 단백질이 암 표지자인지 밝혀지면, 한 번의 피 검사로 여러 수십 개의 암을 밝혀낼 수 있다. 원리는 다음과 같다.[그림5 참조] 한 방울의 혈액에 100개의 단백질 표지자가 있다고 가정하자. 특정 단백질을 화학적 전처리하여 단백질 단편으로 만든 후 질량 이온 스캔으로 질량(Q1)을 측정한다. 같은 단백질 단편을 분쇄하여 단백질 파편으로 만든 후 질량 이온 스캔으로 질량(Q3)을 측정한다. 각 단백질은 지문 같은 고유의 Q1/ Q3 질량 값이 있다. 연구팀은 100개 단백질의 고유의 Q1/ Q3 값을 질량분석기에 미리 입력한다. 그 후 혈액을 질량분석기에 넣고 msec (1000 분의 1초) 단위로 혈액 속 단백질 입자들을 스캔하여 질량을 분석하고, 결과 값과 미리 입력한 단백질 고유의 Q1/ Q3값과 대조한다. A 단백질의 Q1/ Q3값이 400/ 200이라고 하자. 혈액 내 단백질 입자들 중 Q1/ Q3값이 400/ 200인 것이 30개가 있으면, A 단백질이 30개가 있다는 뜻이다. 연구팀은 30개의 유방암 세포주를 화학적 전처리 후에 발생한 319개의 단백질 단편 시료 중 162개를 한국 Seoul 팀, 미국 서부 Seattle 팀, 미국 동부 Boston 팀으로 이송하여 동일한 질량분석기와 기술로 단백질을 정량하였다. 미국 시애틀, 보스턴, 서울의 3팀이 동일 장비 재료를 이용하여 분석을 수행했습니다. 그 결과, 각 3팀 간의 162개 단백질 단편의 분석치 변화의 평균은 0.2% 이내였다. 이것은 개발된 분석 기술과 플랫폼이 전 세계적으로 표준화 기술이 될 수 있음을 의미합니다. 이는 언제 어디서든 동일한 질량분석기와 검사법을 따르면 동일한 단백질 정량 값을 얻을 수 있다는 뜻이다. 즉 국제적으로 대규모 단백질체에 대한 절대 정량 분석 기술이 가능해져 대량 단백질 표지자의 절대 분석 시대가 열린 것이다. 김영수 교수는 “대규모 단백질 표지자가 전 세계적으로 동일한 기술로 정량이 가능해지면 암 질병의 치료진단, 개인 맞춤의학 등의 의료 기술 발전에 획기적으로 기여 할 것입니다. 또한 질량분석기 기반의 초고속 다중 분석 기술을 이용한 혁신적인 진단 장비가 개발되고 이를 이용한 관련 산업이 새롭게 발전할 것으로 기대합니다.” 고 말했다. 본 연구에서 개발된 분석기술 및 자료는 2014년 1월 미국 NIH 산하 ASSAY PORTAL site 에 업로드 되어 전 세계의 연구자들이 이용하게 될 예정이다. 이 연구는 국제 저명 학술지인 Nature Methods 인용지수(Impact factor=23) 에 12월 온라인 호에 게재되었다. [그림1] 국제공동연구팀의 구성 및 연구 진행 과정 ● 319개 유방암 세포주 단백질을 30개의 유방암 세포 주에서 정량 분석 ● 319개 단백질은 질량분석기 기반의 MRM 분석으로 절대 정량 분석함 ● 319개 단백질 중의 162개 단백질 단편은 각 연구실 (Site 1: 시애틀 팀, Site 2: 보스톤 팀, Site 3: 서울 팀) 로 이송되어 동일한 질량분석기 및 SOP를 사용하여 정량됨. ● 3개 site에서 동일한 162개 단백질 단편 시료를 분석하여 표준화 분석 정도를 측정하고, 3개 연구실 특이적인 157개 단백질 단편 시료는 각각 3개 site에서 독자적으로 각각 분석. [그림2] 국제공동연구팀의 정량 분석 결과 ● 국제공동연구팀의 3개 site (Site 1: 시애틀, Site 2: 보스톤, Site 3: 서울) 에서 동일한 162개 단백질 단편 시료를 사용하여 3개 site 의 정량 분석치의 차이 정도를 분석함 ● 좌측 그림에서 3개 site (Site 1: 시애틀, Site 2: 보스톤, Site 3: 서울) 의 중앙값 C.V. 는 5.0%, 7.4%, 5.1% 으로 다른 대륙 (미국 및 아시아) 에서도 재현성이 뛰어난 분석 기술임을 증명 ● 우측 그림에서 3개 site (Site 1: 시애틀, Site 2: 보스톤, Site 3: 서울) 에서 정량 분석한 측정치의 평균적 %차이는 약 0.2% 로서 각 3개 site 의 절대 분석치의 값이 일정함. 이로서 전 세계적으로 동일한 정량분석 기기 및 방법을 이용할 수 있음을 검증하였음. 이는 추후에 세계적으로 표준화된 분석기기 및 기술을 확립하는데 기여할 것임. [그림3] 단백질체 정량 분석 정보를 유전체연구에 보완적 활용 ● 유방암 세포주 30개 (각 그림의 오른쪽 세로 글씨) 에서 ER (estrogen receptor) 발현 유무 (ER+/ER-, 하늘색/파란색 세로바) 에 따라서 발현 차이를 보이는 단백질 및 mRNA (아래쪽 가로 글씨) 에 대한 각각 정량 분석 정보를 나타냄. “Protein data”, “Gene data”에서 발현 정도는 색깔 변화로 표시함. ● 왼쪽 그림은 단백질 정량 정도를, 오른쪽 그림은 mRNA 발현을 나타냄 ● 좌우 그림의 위 회색 바는 단백질 정량 정보 (44개) 에 의해서만 ER+/- 분류가 가능함을 나타내고 위 초록 바는 mRNA 정량 정보 (7개) 만으로 ER+/- 분류가 가능하다. 빨간 바는 mRNA 및 단백질 정량 정보 (18개) 가 함께 ER+/- 분류를 가능하게 함. ● 유방암 세포주의 subtype 분류는 유전체 정보 (mRNA) 에 단백질 정량 정보를 보완하면 더 효과적인 유방암 subtype 분류가 가능함을 보여줌. 즉, 유전체 정보 및 단백질체 정보가 혼합된 유전단백질체 정보가 개인 맞춤의학에 더 효율적임을 보여줌. [그림4] 질량분석기의 다중 단백질표지자 정량 분석에 의한 진단 ● 위의 그림은 본 기술이 개발한 대규모 단백질 정량 분석 기술이 개인 맞춤의학에 적용될 수 있는 미래의 적용 일례를 나타냄. ● 혈액 혹은 인체 체액 중의 100-300개 이상의 다중 단백질 표지자를 질량분석기 기반의 진단 기기에 의해서 정량 분석함. ● 피 한방울 혹은 인체 조직 시료 (~단백질 시료로 1 μg) 에서 100-300개 단백질 표지자를 정량하여 다변수 분석을 통한 예측 모델을 통하여 암 등의 질병을 예측함. ● 대규모 단백질 정량으로 1달에 한번 초고속 초저가의 분석을 통하여 얻어진 정보를 매달 비교 분석하여 건강 상태 및 질병의 획득 확률을 제시할 수 있음. 개인의 건강 자료를 매월-매년 차트화하여 보관하면 건강 이상에 대한 추적 감시가 가능할 것임. ● 현재, 대규모 단백질 표지자의 초저가 고효율 정량 분석 기술은 개발되었으나 질병 예측을 위해서 임상 적용 가능한 단백질 표지자가 충분히 개발이 필요함. 따라서 앞으로 해결할 과제는 충분한 질병 및 건강 표지자의 개발이 매우 필요함. 끝. [그림5]다중반응검지법(Multiple Reaction Monitoring,MRM) 원리 ● 질량분석기 중에서 Triple Quadrupole Mass Spectrometer를 Liquid Chromatography (LC) 에 연결하여 단백질을 정량하는 질량 분석 기법 ● 인체 시료와 같은 액상 시료 I μg 이하 시료의 한번 주입으로 100-300개 이상 단백질 단편의 동시 절대 정량 분석이 가능 ● 정량하려는 타겟 단백질을 tyrpsin 등으로 가수분해하여 만든 peptide 질량 (precursor ion m/z, 오른쪽 그림의 Q1에서 측정)를 MS1 스펙트럼으로 측정하고 그 peptide 를 분쇄하여 (Q2에서 분쇄) 만들어진 조각 질량 (product ion m/z, Q3에서 측정)을 MS2 스펙트럼으로 측정한다. ● MS1 의 precursor ion m/z 및 MS2 의 product ion m/z 을 Transition 이라 정의한다. 각 단백질 마다 지문 같은 고유한 Transition을 지정할 수 있다. 일례로, 가운데 그림의 “Transition = 400.24/205.21”은 Target Protein A를 지정하는 값이다. ● 100 개 단백질의 정량을 위해서는 100개 각각 단백질에 대한 Transition을 정하여 질량분석기에 입력하고 msec 단위로 100개를 연속적으로 스캔한 질량 강도를 측정하면 각각 해당하는 단백질 농도를 절대 정량 분석할 수 있다. ● 동위원소 치환된 peptide를 Internal Standard 로 시료에 첨가하면 절대 정량 분석이 가능하고 적절한 전처리 분획에 의해서 ng/ml 농도의 민감도의 분석이 가능하다. 끝. 논문 원문 보기